利用血細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)：

像數(shù)1，2，3那樣簡單

許多關(guān)于細胞利用的一些生物學應(yīng)用，如微生物學、細胞培養(yǎng)、血液檢查等要求我們在實驗中確定細胞的濃度。

細胞計數(shù)非常簡單，需要有一個計數(shù)板，稱為血細胞計數(shù)板，或 血細胞計數(shù)器。19世紀法國解剖學家louis-charles malassez發(fā)明了這種血細胞計數(shù)板。血細胞計數(shù)板是由一片較厚的特制玻片構(gòu)成，中間有一個垂直線網(wǎng)格。網(wǎng)格的尺寸是給定的，因此每條線覆蓋的區(qū)域是已知的，這樣就可以對一定體積內(nèi)的溶液中的細胞數(shù)量進行計數(shù)，為后期的 血細胞檢測 奠定基礎(chǔ)。

*為常見的血細胞計數(shù)板類型的中部有一個“h”形結(jié)構(gòu)，上面有兩個像鏡子一樣拋光的網(wǎng)格表面，并可在上面加上外罩。

加載血細胞計數(shù)板

開始進行計數(shù)之前，用擦鏡紙拭去灰塵顆粒，確保血細胞計數(shù)板及其蓋玻片處于潔凈狀態(tài)。安裝在血細胞計數(shù)板上的蓋玻片是特制的，明顯厚于傳統(tǒng)的顯微鏡蓋玻片， 這是因為它必須能夠克服液滴的表面張力。

確保在加載細胞懸液之前，先將蓋玻片放置在計數(shù)表面，然后將吸液頭和樣本放進其中的一個v型孔中，并小心地擠出樣本。利用毛細管作用充填蓋玻片下部的區(qū)域。必須放入足夠的液體以便覆蓋整個鏡片的表面，通常需要大約10ul，但不要溢出表面。您可以在一臺血細胞計數(shù)板中加載兩個樣本，每個樣本進入兩個網(wǎng)格。

將加載完的血細胞計數(shù)板放置在顯微鏡臺上，然后將計數(shù)格在低倍鏡焦距中顯示。將樣本靜置幾分鐘，不要移動蓋玻片，以免產(chǎn)生氣泡導(dǎo)致計數(shù)困難。

在血細胞計數(shù)板上進行血細胞計數(shù)

一個血細胞計數(shù)板的整個網(wǎng)格包括9個方格，每個方格的面積為1mm2。 血細胞計數(shù) 板的中心區(qū)域有25個較大的方格，每個大的方格中又包含16個小方格。當進行計數(shù)時，僅對那些位于大方格兩側(cè)的各行中的細胞進行計數(shù)，以避免重復(fù)計數(shù)。懸液必須稀釋到足夠的程度，這樣，細胞或其它顆粒才能均勻分布，不會再網(wǎng)格中相互重疊。

為了判斷細胞的活性， 通常采用一種特殊的染色劑（如用臺盼藍稀釋樣本）。這種染色方法，又稱為染色排除法，選用一種重氮染料，它可以進入死細胞的細胞膜，將它們?nèi)境伤{色；而這種染料不會被活細胞的細胞膜所吸收，由此，活細胞不會被染色。當在顯微鏡下進行觀察時，死細胞呈深藍色。

為了進行計數(shù)，需要確定在所選的方格內(nèi)識別目標細胞類型并計算系統(tǒng)化細胞計數(shù)所需的放大倍數(shù)，這樣總計數(shù)大約為100個，這是統(tǒng)計學顯著性計數(shù)所需的*低細胞數(shù)量。

對于較大的細胞，您只需對角上的四個和中間的一個大方塊中的細胞進行計數(shù)即可。對于小細胞的濃懸浮液，您可能希望對中間方格的4個外部和中間的方格進行計數(shù)，或進一步稀釋懸液。

切記！如果存在細胞與邊線重疊的情況，若與頂部或右側(cè)邊線重疊，其計算在“內(nèi)”；若與底部或左側(cè)邊線重疊，其計算在“外”。

如果中間區(qū)域和每個角落的方格為1 mm x 1 mm = 1 mm2:每個方格的深度為 0.1 mm。每個方格在該深度的*終體積為100nl。

一旦您獲得了細胞計數(shù)的總數(shù)，可以通過下列公式計算細胞濃度：

細胞總數(shù)/ml＝統(tǒng)計的細胞總數(shù)×（稀釋因子/方格數(shù)）×10，000細胞/ml

因此，如果您用1:1的臺盼藍對樣本進行稀釋，并在4個角落的方格加上中間大方格中統(tǒng)計得到325個細胞，則每毫升（ml ）中細胞總數(shù)=：

325個細胞 × [2(稀釋因子)/5個方格] × 10，000 細胞/ml = 130 ×104 細胞/ml

如果您想知道原先樣本中有多少細胞，只需用總的樣本量乘以細胞濃度即可。

例如，如果您原先的樣本量是5ml，則您的樣本中總計擁有=:

130 ×104細胞/ml × 5ml = 650×104個細胞